LAPORAN
RESMI
PRAKTIKUM EMBRIOLOGI
DAN REPRODUKSI HEWAN
“PEMBUATAN
PREPARAT IRISAN USUS KATAK RANA SP
DENGAN METODE PARAFIN”
Disusun oleh:
Nama : Dewi
Noviana
NIM :
K4309023
Prodi : Pendidikan Biologi 2009(A)
Tanggal
Pelaksanaan: Sabtu, 19 Mei
2012
FAKULTAS
KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN
UNIVERSITAS
NEGERI SEBELAS MARET
SURAKARTA
2012
LAPORAN RESMI
PRAKTIKUM
EMBRIOLOGI DAN REPRODUKSI HEWAN
I.
JUDUL
: Pembuatan Preparat Irisan Metode Parafin
II.
TUJUAN
Membuat preparat irisan melalui penyelubungan dengan
metode parafin menggunakan pewarnaan hematoxylin eosin
III.
DASAR
TEORI
Pada umumnya kita mengenal dua teknik persiapan
pembuatan preparat untuk pengamatan
dengan menggunakan mikroskop optik, yaitu:
· Preparat
basah
· Preparat
kering
Pembuatan
preparat dengan metoe parafin sekarang banyak digunakan karena hamper semua
jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini.
Kebaikan-kebaikan
metode parafin: irisan jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau
metode selvidin. Tebal irisan engan metode parafin dapat mencapai rata-rata 6
mikron, irisan-irisan yang bersifat seri apat dikerjakan engan mudah, proses
jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode selvidin.
Kekurangan
metode parafin: jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah, jaringan yang
besar tidak dapat dikerjakan, sebagian besar enzim-enzim akan larut dalam
metode ini.
Metode irisan
dengan metode ini menggunakan alat pengiris jaringan yang disebut mikrotom.
Keuntungan dari adanya alat ini adalah tebalirisan dapat diatur menurut tujuan
dan kehendak peneliti.
Pada mikrotom
terdapat bagian-bagian: skala, pisau, pegangan atau tempat jaringan, pengatur
jarak antara tempat jaringan dengan pisau mikrotom.
Metode parafin
adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di
dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan ataupun
tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan penyelubungan karena
jaringan merupakan bahan yang lunak. Pembuatan sediaan dengan pemotongan
jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya.
Dilakukan infiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai
penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses
penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan
masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom,
penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya
bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan
tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah
diwarnai lalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama
(Tjiptrosoepomo, 1993).
Prosedur
pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada
jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertama–tama organ yang akan dijadikan
preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24 jam,
didehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing
dengan xilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang
masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan
mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke
dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan,
proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan
dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk
jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan
safranin ataupun fast green. Setelah diwarnailalu dimounting, diberi perekat
entellan, dan diberi label nama (Santoso, 2002).
Pada organ
hewan, Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan
kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis
dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam
embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan
atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku
pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan
dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.
Proses
penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel,
sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi
empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil
sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan
ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut
diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki
kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik
(Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan
merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan
hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Ada beberapa
macam paraffin yaitu paraffin lunak dengan titik leleh 48oC, paraffin medium
dengan titik leleh 52oC, dan paraffin keras dengan titik leleh 56oC. Waktu yang
dibutuhkan di setiap tahapan paraffin yaitu 15-20 menit. Tidak perlu waktu yang
cukup lama karena dilakukan di dalam oven yang menyebabkan jaringan kuat dan
rapuh (Botanika, 2008).
Embedding
dilakukan dengn membuat kotak kertas. Beberapa keuntungan menggunakan kotak
kertas yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai jaringan. Sebelum jaringan
atau sampel ditanam maka terlebih dahulu paraffin dalam kotak harus membeku
pada bagian dasarnya sehingga memungkinkan objek tidak langsung menempel pada
dasar kertas. Blok paraffin yang akan disayat dulu maka dibentuk dulu (trimming).
Bentuk blok disesuaikan dengan bentuk pitanya yang diinginkan. Hal in
dikarenakan penampang blok paraffin menggambarkan blok pita yangg akan
diiris.Letak mata pisau pada mikrotom sangat menentukan hasil yang diperoleh.
Pisau dibersihan dengan xylol dari sisa-sisa paraffin yang menempel. Hasil
sayatan diambill dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Hasil sayatan
diletakkan dalam bak khhusuus dann diperhatikan urutannya. Pita hasil sayatan
ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca objek
selanjutnya diletakkan di atas meja penangans (heating plate) (Botanika, 2008).
Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelekat
alami yang sangat baik (Hugo, 2008).
Sangatlah
penting dilakukan rehidrasi atau dehidrasi sebelum dilakukan pewarnaan. Hal itu
baru dilakukan bila paraffin dalam sayatan sudah larut dan biasanya dilarutkan
dalam xylol (Botanika, 2008).
Proses sectioning diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Irislah sedemikian rupa, sehingga preparat akan terletak tepat berada di tengah blok. Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasindengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa
Proses sectioning diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Irislah sedemikian rupa, sehingga preparat akan terletak tepat berada di tengah blok. Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasindengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa
Mikrotom ada
beberapa macam yaitu :
1.
Mikrotom geser
(sliding mikrotome). Pada alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya,
sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan
mikrotom geser adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dulu.
Disini tidak akan terjadi pita irisan. Jaringan yang akan diiris sebelumnya
dapat diwarnai dengan pewarnaan tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih
dahulu. Metode ini banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.
2.
Mikrotom beku
(freezing microtome). Alat ini dihubungkan dengan tabung berisi CO2 dingin,
melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini, keadaannya sama dengan mikrotom geser
yaitu jaringan tetap berada pada tempatnya sedang pisau mikrotomnya yang
bergerak ke muka dan ke belakang.
3.
Mikrotom putar
(rotary microtome). Berbeda dengan 2 jenis mikrotom diatas, yaitu bahwa pada
mikrotom ini, pisau tetap pada tempatnya sedang jaringannya yang bergerak
ke atas dan ke bawah. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan
untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin (Rina, 2010).
IV.
ALAT
DAN BAHAN
a. Alat
1.
Papan paraffin 1 buah
2.
Pisau bedah 1 buah
3.
Jarum pentul secukupnya
4.
Gunting bedah 1 buah
5.
Cawan petri 1 buah
6.
Pinset 1 buah
7.
Gelas bekker 1 buah
8.
Objek glass 9 buah
9.
Deg glass 9 buah
10.
Kuas 1 buah
11.
Staining jar 1 buah
12.
Tabung untuk
fiksasi 1 buah
13.
Gelas-gelas
petri secukupnya
14.
Mikrotom 1 buah
15. Hot plate 1 buah
16.
Mikroskop 1 buah
b. Bahan
1.
Usus katak (Rana
sp) 1 buah
2.
Alcohol 70%,
80%, 90%, 96%, absolute (100%) secukupnya
3.
Larutan xylol secukupnya
4.
Paraffin secukupnya
5.
Larutan Bouine secukupnya
6.
Larutan
hematocilin secukupnya
7.
Eosin secukupnya
8.
Larutan Entellan secukupnya
9.
Aquades secukupnya
10. Meyer
albumin secukupnya
11. Larutan
ringer secukupnya
V.
CARA
KERJA
1.
Mneyiapkan
alat dan bahan yang diperlukan dalam praktikum.
2.
Narcose
(pembiusan),
Ø Membasahi kapas dengan eter kemudian
ditempelkan pada nares anterior katak
3.
Pengambilan
jaringan (Diseksi/Collecting),
Ø Membedah tubuh katak Rana sp dan mengambil
organ bagian ususnya.
4.
Washing
Ø Merendam organ pada
alkohol 70%, mengganti alkohol tiap 1 jam hingga warna
alkohol menjadi
jernih
5.
Dehidrasi
Ø Merendam organ pada
alkohol 80% selama 1 jam
Ø Merendam organ pada
alkohol 90% selama sehari
Ø Merendam organ pada
alkohol 96 % selama 1 jam
Ø Merendam organ pada alkohol absolute selama
1 jam
6.
Clearing
Ø Merendam organ pada larutan toluol selama
semalam
7.
Infiltrasi
Ø Memasukkan
organ pada kotak kertas yang berisi
toluol:paraffin (1:1) cair, oven dalam suhu 56o - 58o C,
selama 1 jam
Ø Memasukkan
organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o -
58o C, selama 1 jam (I)
Ø Memasukkan
organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o -
58o C, selama 1 jam (II)
Ø Memasukkan
organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o -
58o C, selama 1 jam (III)
8.
Embedding
Ø Menanam organ dengan memposisikan organ
dalam kondisi melintang/membujur pada paraffin cair dalam kotak kertas
9.
Section
(pemotongan)
Ø Mengeluarkan Blok paraffin dari cetakan, diiris dengan
scalpel sehingga berbentuk segi empat
Ø Melekatkan blok paraffin pada holder kayu, memastikan
tidak goyah
Ø Memasang holder+paraffin pada rotary mikrotom
Ø Memotong dengan ketebalan 5 mikron, jika
pemotongan belum mencapai organà10-15
mikron
Ø Menyiapkan kertas polos untuk tempat pita preparat
serta kuas untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom
10. Affixing
Ø Menetesi Objek glass dengan albumin meyer
Ø Meletakkan Coupes yang terpilih di atas objek glass
tersebut dan merentangkan
11. Deparafinisasi
Ø Menginkubasi preparat pada suhu 65 C selama 30 menit
Ø Merendam preparat dalam xylol (2 x 30 menit)
Ø Merendam preparat dalam alcohol absolute (2 x 10
menit)
Ø Merendam preparat dalam alcohol 90% selama 5 menit
Ø Merendam preparat dalam alcohol 70% selama 1 menit
Ø Merendam preparat dalam alcohol 50% selama 1 menit
Ø Merendam preparat dalam
alcohol 30% selama 1 menit
12. Staining (Hematoxylin&Eosin)
Ø Membersihkan cairan yang berlebihan di sekeliling
jaringan
Ø Menstain dengan larutan hematoxylin, ratakan
Ø Menginkubasi pada suhu ruang selama 5 menit
Ø Membilas pada aliran air kran dalam posisi terbalik
(bagian yang ada jaringannya di sebelah bawah)
Ø Membersihkan cairan yang berlebihan di sekeliling
jaringan
Ø Menstain dengan larutan eosin selama 30 detik
Ø Membilas pada aliran air kran dalam posisi terbalik
(bagian yang ada jaringannya di sebelah bawah)
Ø Mendehidrasi preparat dalam alcohol absolute (2 x 2
menit)
Ø Membersihkan
preparat dalam xylol (2 x 10 menit)
13. Mounting
Ø Menutup preparat dengan Canada balsam/enthellan dan
degglass (Apabila hasil pewarnaan
jelek, tidak perlu mounting)
14.
Labeling,
Ø Menulis data lengkap dengan preparat yang telah
dibuat pada label yang kemudian ditempel pada salah satu sisi obyek glass
15.
Mendata
hasli praktikum
Ø Membuat gambar Preparat yang telah berhasil secara
lengkap dan membuat laporan
VI.
HASIL
PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN
Metode
paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua
jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari
suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat
diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode
paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling
umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada hewan ataupun pada
hewan (Anonim, 2011).
Metode parafin merupakan cara pembuatan
preparat permanen yang menggunakan parafin sebagai media embedding dengan tebal
irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8 mikron. Metode ini memiliki irisan yang
lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin yang tebal
irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron. Langkah-langkah penting dalam metode
ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, embedding,
penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, dan penutupan. Larutan fiksasi
yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan Bouine. Larutan fiksasi ini
merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai suatu sel dengan spesimen
diiris setipis mungkin. Hal ini mendukung laju fiksasi dalam sel (Botanika
2008).
Berikut langkah-langkah dalam metode paraffin secara umum adalah:
A.
Pembiusan
(Narcose)
Pembiusan
merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk
memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan
tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang
menyangkut kelenjar-kelenjar(endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh
terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya.
Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:
Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:
1.
Eter, biasanya
digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing
2.
Kloroform,
biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton- CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton- CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.
B.
Pengambilan
jaringan (Diseksi/Collecting)
Diseksi
merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami
baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar
dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan
proses pencucian (washing).
Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan dengan tumbuhan.pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keaadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai:
Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan dengan tumbuhan.pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keaadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai:
1.
NaCl 0.8-0.9%
2.
Larutan Ringer,
dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi larutan ringer
adalah:
· NaCl,
CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas.
· NaCl,
CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin.
· NaCl
merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15
menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan
menyebabkan pembengkakan sel.
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut:
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut:
a.
objek yang
diambil dalam kondisi sehat
b.
objek yang
diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan
c.
menggunakan
pisau yang tajam
d.
ukuran jaringan
yang diambil kurang lebih 0.5 cm
e.
langsung dicuci
dan difiksasi.
C.
Fiksasi
(Fixation)
Fiksasi adalah
usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap
berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran..
media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri
dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi
agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan. Fiksatif
yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA
(Formaldehyde Acetic Acid).
FAA ini
juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan
adalah:
· Formalin
…………………………. 10 ml
· Alkohol
70% …………………………. 90 ml
· Asam
asetat grasial …………………. 2 ml
Lama
fiksatif 3 jam, tanpa pencucian. Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif
tergantung pada:
· Jenis
jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan
intestinum
· Tebal
atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan
yang difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan
· Jenis
fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.
Proses
yang disiapkan dalam menyiapkan materi segar dalam pengamatan mikroskopis yaitu
fiksasi. Tujuan dilakukannya fiksasi adalah mencegah kerusakan jaringan, Faktor-faktor yang berperan dalam
fiksatif adalah buffer (pH), suhu yang rendah mencegah autolisis,untuk
mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis mungkin,
perubahan volume, osmolaliitas pada larutan fiksatif, penambahan deterjen
sehingga fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif. Dehidrasi
memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yang digunakan untuk
dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan
secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol
kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut.
Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali .
Tujuan
dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin
adalah:
· mematikan
(menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan
keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
· mencegah
terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun
kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang
dikenal dengan autoloisis.
· Meningkatkan
daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan
komponen jaringna fiksatif.
D.
Aerasi
Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di vakum, yang bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi.
Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di vakum, yang bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi.
E.
Dehidrasi
(dehydration)
Dehidrasi
adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan
kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan
yang telah difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara
memasukan sample ke dalam larutan dehidrasi secara berseri dari konsentrasi
rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai konsentrasi air. Dehidran yang
paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah alkohol.
Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot
oil. Alkohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatife lebih
murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan
untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang,
dan embrio. Dalam penggunaan alcohol dipakai serial dengan konsentrasi yang
berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi
(35%-50%-70%-80%-95%-100%). Lama perendaman tergantung untuk masing-masing
konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai stoping point, jaringan di
malamkan.
Proses
dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alcohol dilakukan setingkat demi
setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara
tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang
terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti
masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi
ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat
penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah
lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus
dikembalikan ke dehidran.
F.
Penjernihan
(Clearing)
Clearing
merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari
penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan
yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih
sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan
atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan
warna sesuai dengan warna pewarnanya. Lama jaringan dalam medium penjernih
tergantung pada:
· Ketebalan
dan tingkat kepadatan jaringan
· jenis
reagen yang dipakai
· bila
dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga
tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan
mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk di sayat.
· Jenis
jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam
menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung
menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene.
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:
1.
minyak aniline
2.
Benzene
3.
karbon
tetraklorida
4.
karbon bisulfida
5.
minyak kayu
cadar
6.
kloroform
7.
minyak cengkeh
8.
Xylol
G.
Infiltrasi
(Infiltration)
Infiltrasi
adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam
jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih
(clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah
paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya
dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan
hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh 56-58C.
Dalam
proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam
paraffin murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih
dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan
perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu
lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan.
Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri prubshsn
lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini dapat
menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi
sangat mengkerut,dll.
Setelah
dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke
paraffin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara
30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven.
Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.
Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.
H.
Penanaman
(Embedding)
Embedding
atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam
balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan
bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin
yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen.
Embedding
merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses
ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan
mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu
bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel
akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian
dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan
dengan parafin sampai membeku.
|
Gambar proses
embedding
|
Selanjutnya
dilakukan pengeblokan atau embedding, pengeblokan ini mengguna-kan kotak atau
takir yang dibuat dari kertas kalender. Pada saat pengeblokan spesimen
diletakkan sesuai posisi yang diinginkan. Setelah itu parafin didinginkan
dengan segera. Setelah dingin maka dilakukan pengirisan, pengirisan digunakan
alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron sampai 14 mikron. Irisan akan
berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan menggunakan kuas kecil yang
telah dibasahi ujungnya dengan air (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Paraffin
yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama
dengan paraffin yang digunakn waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai
pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat memang
sudah bersih dari bahan penjernih.
Hal-hal
yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah:
· Paraffin
yang digunakan benar-benar bersih dan murni
· Peralatan
yang digunakan benar-benar khusu untuk prose situ saja
· Pembuatan
balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar lebih cepat,
susunjaringan sesuai dengan orientasi yang direncanakan.
· Jaringan
sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar.
· Untuk
jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup
· jangan
sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama dekat
jaringan.
I.
Penyayatan
(Sectioning)
Proses
penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah
terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan
jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop. Pembuatan irisan dengan
metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah yaitu proses
embedding lebih cepat dan lebih simpel, material embedding dapat disimpan dalam
waktu yang lama pada kondisi kering, serta dapat membuat irisan yang tipis.
Embedding menggunakan paraffin sangat baik digunakan untuk studi embriologi,
anatomi dan sitologi (Khasim, 2002).
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.
Mikrotom
adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis
untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan
digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam
histologi(Wikipedia).
Jenis-jenis
mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:
· Rocking
microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras
seperti kayu
· Rotary
microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akan
mengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini
biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin
· Sliding
microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang
bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada mikroteknik metode
paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam
celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras
· Freezing
microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang
tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat
adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2.
Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakai lebih pendek, karena
langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature
kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.
Hal-hal
yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:
· Mikrotom
harus seberat mungkin
· Meja
tempat mikrotom harus stabil
· Pisau
harus cocok dengan mikrotom
· Posisi
pisau harus stabil
· Mata
bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang
akan disayat.
J.
Penempelan dan
Afiksasi (Afixing)
Affixing
adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan
bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan
pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.
Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah sebagai berikut :
Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah sebagai berikut :
· Putih
telur sebanyak 50 bagian§
· Gliserin
sebanyak 50 bagian§
· Kristal
Tymol beberapa butir§
· Akuadest
beberapa tetes§
K.
Deparafinasi dan
Pewarnaan (Staining)
Deparafinasi
adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk
membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi
aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini
untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari paraffin.
Pewarnaan
merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas
berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah
dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk
diamati.
Pewarnaan
akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan
dibedakan antara non vital dengan vital
· Pewarnaan
non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi.
Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama
untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan
praktikum bagi mahasiswa.
· Pewarnaan
vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan
hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna
maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat
warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai
contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati
penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat
warna.
· Pewarnaan
supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati.
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati.
Ditinjau
dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada
kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah pembagian zat warna bergasarkan
berbagai kategori tersebut.
· Berdasarkan
sifatnya, meliputi:
1.
Zat warna asam,
adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang tidak
berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain sebagainya
2.
Zat warna basa,
adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan radikal asam yang tidak
berwarna.
· Berdasarkan
asalnya, meliputi:
1.
Zat warna alami,
berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari
hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan
(Hehatoxylin campechianum)
2.
Zat warna
sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik. Contoh: basic
fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin.
· Berdasarkan
kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:
1. Zat
warna substantife
Jenis zat warna
yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus green B, Neutral
red.
2. Zat
warna ajektif
Jenis zat warna
yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus menggunakan
bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut
diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai
mordan.
· Berdasarkan
jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi:
1)
Pewarna tunggal
(single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna, contohnya untuk
melihat polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka digunakan zat warna
tunggal gentian violet.
2)
Pewarna ganda/
rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system
pewarnaan hematoxilin-eosin
3)
Pewarnaan
rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna, contohnya
formula Marllory triple stai yang menggunakan zat-zat warna acid fuchsin, aniline
blue serta orange G.
4)
Pewarnaan
rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk tujuan khusus.
· Berdasarkan
struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:L
1)
Pewarnaan umum,
seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safrani
2)
Pewarnaan
khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline blue, asam
phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.
Dengan adanya
preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada
dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau
awet agar sewaktu-waktu dapat diamati kembali. Dalam pembuatan preparat
hendaknya dipahami karakteristik yang akan diambil sebagai spesimen. Perbedaan
karakteristik hewan yang akan diambil sebagai spesimen menentukan larutan
fiksatif dan zat warna yang akan digunkan dalam pembuatan preparat (Setjo,
2004).
Karakteristik
hewan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada tahap-tahap
pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan
mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya
menjadi kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini
tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan,
perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang
dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan
menentukan keberhasilan preparat irisan (Setjo, 2004).
Pada prinsipnya
pembuatan preparat irisan terdiri atas beberapa tahap yaitu koleksi specimen,
fiksasi, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi, pengeblokan, pengirisan,
penempelan, pewarnaan dan mounting. Prinsip koleksi specimen adalah specimen
tidak mengalami kekeringan dan kerusakan sebelum difiksasi. Tujuan fiksasi
adalah untuk mematikan dengan cepat spesimen yang berupa jaringan dan sel-sel
juga utuk mempertahankan struktur sel dan jaringan sebagaimana aslinya. Udara
dalam jaringan spesimen harus dikeluarkan terlebih dahulu kemudian diganti
dengan larutan fiksatif (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Selanjutnya
dilakukan dehidrasi yaitu tahap pengeluaran air dari jaringan dengan perendaman
alkohol secara bertingkat dan dalam jangka waktu tertentu. Kemudian pengambilan
alkohol dilakukan dengan perendaman dalam xylol secara bertahap dengan jangka
waktu tertentu. Proses penggantian larutan penjernih dengan merendam spesimen
dalam parafin. Penggantian xylol dalam jaringan oleh parafin berlangsung secara
berangsur-angsur. Proses penggantian ini berlangsung di dalam oven sehingga
xylol tidak menguap dan parafin tidak membeku. Temperatur oven lebih tinggi
sedikit di atas titik cair parafin (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).
Penempelan
menggunakan perekat albumin meyer kemudian disimpan dalam kotak pengering (hot
plate). Selanjutnya akan dilakukan pewarnaan dan mounting. Dalam proses
pewarnaan dilakukan dalam jangka waktu tertentu, jika terlalu lama atau terlalu
singkat dapat menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau bahkan terlalu
gelap. Selanjutnya dilakukan mounting dengan ditetesi balsam kanada sehingga
irisan akan tetap awet dengan struktur sel serta jaringan (Widjajanto dan
Susetyoadi Setjo, 2001).
Proses
penempelan spesimen ke kaca benda tidak benar-benar melekat sehingga saat
pewarnaan spesimen ada yang lepas. Agar spesimen dapat menempel sempurna pada
kaca benda dibutuhkan tenggat waktu yang cepat antara peletakkan spesimen pada
kaca benda yang telah diberi pelekat berupa albumin meyer. Setelah benar-benar
melekat di kaca benda maka irisan yang berada di kaca benda dipanaskan di atas
lampu spiritus untuk lebih memaksimalkan perlekatannya (Widjajanto dan
Susetyoadi Setjo, 2001).
Zat warna yang
digunakan tidak hanya satu macam karena tidak semua sel dapat menyerap satu
macam zat warna. Pada saat pewarnaan preparat jantung merpati inisel dalam
jaringan tidak terwarnai. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu yang digunakan
untuk pemberian warnanya terlalu singkat sehingga zat warna belum terserap
sempurna oleh jaringan. Pewarna yang diberikan pada irisan dalam jangka waktu
tertentu, kurang atau lebih waktu yang digunakan menyebabkan warna preparat
menjadi kurang atau terlalu gelap. Sedangkan hasil preparat yang tidak utuh
dapat disebabkan oleh suhu sekitar ruangan yang kurang mendukung saat dilakukan
pengirisan selain itu masih tersisanya air atau alkohol dalam jaringan juga dapat
menyulitkan dalam pengirisan.
Percobaan ini
membuat preparat dengan menggunakan usus katak Rana
sp
dengan metode parafin. Usus katak Rana sp tersebut dipotong secara
melintang dengan ketebalan 10 mm. Selanjutnya difiksasi
menggunakan larutan alkohol 96% dengan tujuan untuk menjaga atau
mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan
sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih hidup. Kemudian
di dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat yang dimulai dari
konsentrasi 70%, 80%,
90%, dan 96% masing-masing selama 30 menit, dengan tujuan untuk menghilangkan
kandungan air. Selanjutnya melakukan dealkoholosasi yang menggunkan perbandingan xilol
: alcohol yaitu 1:3, 1:1, dan 3:1 masing-masingselama 30 menit,
dengan tujuan mengeluaran alkohol dari jaringan tersebut juga maksimal sehingga
larutan xilol inilah yang nantinya dapat terikat langsung dengan parafin dan
agar jaringan akar tersebut dapat beradaptasi.
Selanjutnya
dilakukan perendaman dengan menggunakan xilol murni yaitu xilol I dan xilol II
masing-masing 30 menit, dengan tujuan agar jaringan betul-betul bebas dari
alkohol sehingga hanya ada xilol yang tersisa. kemudian dilanjutkan perendaman
menggunakan perbandingan xilol : parafin yaitu 1 : 9 selama 30 menit, dengan
tujuan untuk menghilangkan xilol dari jaringan. Kemudian melakukan infiltrasi
dengan menggunakan parafin murni, infiltrasi I dilakukan untuk mencelupkan, hal
tersebut dilakukan untuk menghilangkan kandungan xilol secara maksimum serta
untuk merekatkan jaringan dan infiltrasi II untuk mencetak kedalam box kecil
yang sudah disediakan, hal tersebut dilakukan agar jaringan dapat dengan mudah
terpotong tanpa merusak jaringan akar tersebut. Kemudian dilakukan pengirisan
dengan menggunakan mikrotom, namun hal ini tidak dilakukan karena alat tersebut
sudah tidak dapat digunakan lagi.
Kebaikan-kebaikan
metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan
metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata
diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai
rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan
mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan
dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu
jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar
tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar
enzim-enzim akan larut dengan medode ini (Praptomo, 2010).
Berikut
gambar pengamatan ke 8 preparat:
preparat
|
Gambar pengamatan
|
1.
|
|
2.
|
|
3.
|
|
4.
|
|
5.
|
|
6.
|
|
7.
|
|
8.
|
|
Dari ke 8 preparat terlihat preparat yang berhasil preparat nomer 2 dan
8 saja, sedangkan nomer 1, 3,4,5,6,7 preparat mengalami penumpukkan organ
sehingga tidak terlihat organ asli pada usus katak Rana sp. Berikut pengamatan mikroskopik secara teori yaitu:
Pengamatan
mikroskopis usus katak Rana sp secara teori:
Dari pembesaran
kecil sebuah sayatan dari sepotong usus, nampak sekali sekelompok jonjot-jontot
vili yang berfungsi sebagai tempat penyerapan sari-sari makanan pada sistem
pencernaan aves. Villi ini berbentuk seperti jari ( jonjot) yang merupakan
proyeksi dari mukosa. Di dalam tiap
villi terdapat pembuluhdarah kapiler dan lacteal yangberfungsi untuk transprot
makanyang terabsorpsi. Dinding usus terdiri atas keempat lapisan yang sama
dengan lambung yaitu :
a. Dinding
lapisan luar
b. Dinding
lapisan berotot
c. Dinding
sub mukosa
d. Dinding
mukosa dalam
Dari pembesaran
kecil sebuah sayatan dari sepotong usus, nampak sebagai kelompok lobuli yang
secara kasar berisi enam, tiap – tiap lobules dibungkus oleh jaringan ikat dan
pada sudut – sudut tertentu membentuk pulau pulau yang jelas juga mengandung
pembuluh pembuluh darah dan duktus. Pulau – pulau tersebut adalah kanalis portarum.
Pada sisi yang lurus dari lobulus, kadang dapat terlihat pembuluh – pembuluh
yaitu vena interlobulares. Susunan jaringan ikat yang mengitari lobulus lebih
tipis, hingga kurang jelas. Jaringan lobulus terdiri atas tali – tali radiar
dari sel – sel beralternasi dengan sinusoid – sinusoid. Sinusoid – sinusoid
berkonvergensi ke pembuluh di sentrum lobulus (vena sentralis)
VII.
KESIMPULAN
Kesimpulan yang dapat diperoleh dari hasil
percobaan yang telah dilakukan yaitu metode parafin merupakan suatu cara pembuatan
preparat yang menggunakan parafin sebagai media penanamannya. Pembuatan
preparat pada metode parafin ini terdiri dari beberapa tahap yaitu narcose
(pembiusan), sectio (pemotongan), labelling, fiksasi, washing (pencucian),
dehidrasi, clearing (penjernihan), infiltrasi, embedding, sectioning
(pengirisan), affixing, staining (pewarnaan), mounting (penutupan), dan
labelling (pelabelan).
Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan
yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda
seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi
dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron.
Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan
metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin.
Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras,
mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan,
bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan
medode ini.
VIII.
DAFTAR
PUSTAKA
Amanda.
2007. Membuat Preparat Melintang
Dengan Metode Parafin,http://monocotil.blogspot.com .
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Botanika,
2008.Fixation, Embedding, Sectioning, http://botanika.biologija.org .
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Carlson,
B.M. 1988. An Introduction to Embryology. Ed 5. Philadelphia: W. B.
Saunders
Hugo.
2008. Mayer Albumin. http://www.hardydiagnostics.com/catalog/hugo/MayersA
Plbumin.htm. Tanggal akses 7 November 2008
Humason,
Gretechen L. 1996. Animal Tissue Techniques. San Fransisco: W. H.
Freeman and Company
Lianury,
Robby N, 2000, Histologi, Universitas Hasanuddin Press, Makassar.
Nalbandov.
1990. Fisiologi Reproduksi Pada Mamalia dan Unggas. Jakarta: UI Press
Praptomo,
2010, Pembuatan Preparat Parafin Jaringan Tumbuhan (Mikroteknik), http://www.nagkoyo.com , Diakses
pada tanggal 20 September 2011.
Rina,
2011, Mikroteknik, http://rinaningtyas.blogspot.com ,
Diakses pada tanggal 20 September 2011.
Yatim,
W. 1990. Reproduksi dan Embriologi.
Bandung: Tarsito
Santoso,
H. B. 2002. Bahan Kuliah Teknik Laboratorium. Universitas Lambung
Mangkurat, Banjarbaru
IX.
LAMPIRAN
Dua lembar jawaban pertanyaan parafin
Satu
lembar Laporan
sementara praktikum parafin
Surakarta, 7 Juni 2012
Mengetahui,
Asisten
( )
|
Praktikan,
DEWI NOVIANA
K4309023
|
JAWABAN PERTANYAAN DISKUSI
1. Dalam
pembuatan preparat, Waktu untuk melakukan infiltrasi jaringan adalah 4 jam dengan rincian langkh- langkahnya adalah:
a)
Memasukkan
organ pada kotak kertas yang berisi
toluol:paraffin (1:1) cair, oven dalam suhu 56o - 58o C,
selama 1 jam
b)
Memasukkan organ
pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o - 58o C, selama 1
jam (I)
c)
Memasukkan organ
pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o - 58o C, selama 1
jam (II)
d)
Memasukkan organ
pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o - 58o C, selama 1
jam (III)
2. Larutan
fiksatif yang saya gunakan adalah larutan FAA
(Formaldehyde Acetic Acid. Hal ini dikarenakan
Ø Fiksasi
adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar
tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran.
Ø media
yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari
unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar
Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan.
Ø Formula
FAA untuk jaringan hewan adalah:
· Formalin
…………………………. 10 ml
· Alkohol
70% …………………………. 90 ml
· Asam
asetat grasial …………………. 2 ml
Ø Lama
fiksatif 3 jam, tanpa pencucian. Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif
tergantung pada:
· Jenis
jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan
intestinum
· Tebal
atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan
yang difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan
· Jenis
fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.
Ø Tujuan
dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin
adalah:
· mematikan
(menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan
keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.
· mencegah
terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun
kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang
dikenal dengan autoloisis.
· Meningkatkan
daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan
komponen jaringna fiksatif.
3.
Dalam pewarnaan
menggunakan pewarna hematoxilin eosin. Hal ini
dikarenakan:
· Merupakan Zat warna asam, adalah garam-garam dari
asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang tidak berwarna.
· Merupakan Zat warna alami, berupa zat warna yang
diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin,
adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hematoxylin
campechianum)
· Merupakan Zat warna ajektif, Jenis
zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus
menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada
formula tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang
berfungsi sebagai mordan
· Memiliki Pewarna ganda/ rangkap (double staining,
menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin
· Bersifat Pewarnaan umum pada struktur
jaringan yang akan diwarnai.
LAPORAN SEMENTARA KELOMPOK 2
PRAKTIKUM EMBRIOLOGI DAN REPRODUKSI
HEWAN
preparat
|
Gambar pengamatan
|
1.
|
|
2.
|
|
3.
|
|
4.
|
|
5.
|
|
6.
|
|
7.
|
|
8.
|
|