PEMBUATAN PREPARAT IRISAN USUS KATAK RANA SP DENGAN METODE PARAFIN

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM EMBRIOLOGI DAN REPRODUKSI HEWAN

“PEMBUATAN PREPARAT IRISAN  USUS KATAK RANA SP

 DENGAN METODE PARAFIN”

Disusun oleh:

Nama        : Dewi Noviana

NIM          : K4309023

Prodi         : Pendidikan Biologi 2009(A)

Tanggal Pelaksanaan: Sabtu, 19 Mei 2012

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS NEGERI SEBELAS MARET

SURAKARTA

2012

LAPORAN RESMI

PRAKTIKUM EMBRIOLOGI DAN REPRODUKSI HEWAN

I.                JUDUL : Pembuatan Preparat Irisan Metode Parafin

II.              TUJUAN

Membuat preparat irisan melalui penyelubungan dengan metode parafin menggunakan pewarnaan hematoxylin eosin

III.            DASAR TEORI

Pada umumnya kita mengenal dua teknik persiapan pembuatan  preparat untuk pengamatan dengan menggunakan mikroskop optik, yaitu:

·       Preparat basah

·       Preparat kering

Pembuatan preparat dengan metoe parafin sekarang banyak digunakan karena hamper semua jaringan dapat dipotong dengan baik bila menggunakan metode ini.

Kebaikan-kebaikan metode parafin: irisan jauh lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode selvidin. Tebal irisan engan metode parafin dapat mencapai rata-rata 6 mikron, irisan-irisan yang bersifat seri apat dikerjakan engan mudah, proses jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode selvidin.

Kekurangan metode parafin: jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah, jaringan yang besar tidak dapat dikerjakan, sebagian besar enzim-enzim akan larut dalam metode ini.

Metode irisan dengan metode ini menggunakan alat pengiris jaringan yang disebut mikrotom. Keuntungan dari adanya alat ini adalah tebalirisan dapat diatur menurut tujuan dan kehendak peneliti.

Pada mikrotom terdapat bagian-bagian: skala, pisau, pegangan atau tempat jaringan, pengatur jarak antara tempat jaringan dengan pisau mikrotom.

Metode parafin adalah suatu metode pembuatan preparat dengan melakukan penanaman jaringan di dalam blok parafin untuk menghasilkan preparat jaringan hewan ataupun tumbuhan yang tipis. Preparat parafin ini dilakukan penyelubungan karena jaringan merupakan bahan yang lunak. Pembuatan sediaan dengan pemotongan jaringan menggunakan parafin dan mikrotom sebagai alat pemotongnya. Dilakukan infiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnai lalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Tjiptrosoepomo, 1993).

Prosedur pembuatan sediaan menggunakan metode parafin pada umumnya sama baik pada jaringan hewan maupun tumbuhan. Pertama–tama organ yang akan dijadikan preparat diisolasi terlebih dahulu, kemudian difiksasi minimal 24 jam, didehidrasi dengan alkohol bertingkat selama 30 menit, diclearing dengan xilol murni juga selama 30 menit, diinfiltrasi agar parafin yang masuk berfungsi sebagai penyangga jaringan saat diiris dengan mikrotom, lalu diembedding (proses penanaman) yaitu merendam jaringan ke dalam parafin cair, dan parafin akan masuk ke seluruh bagian jaringan, proses pemotongan dengan mikrotom, penempelan pada kaca objek, pewarnaan dengan haematoksilin (pada umumnya bahan ini yang sering digunakan untuk jaringan hewan) sedangkan jaringan tumbuhan seringkali menggunakan safranin ataupun fast green. Setelah diwarnailalu dimounting, diberi perekat entellan, dan diberi label nama (Santoso, 2002).

Pada organ hewan, Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.

Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.

Ada beberapa macam paraffin yaitu paraffin lunak dengan titik leleh 48oC, paraffin medium dengan titik leleh 52oC, dan paraffin keras dengan titik leleh 56oC. Waktu yang dibutuhkan di setiap tahapan paraffin yaitu 15-20 menit. Tidak perlu waktu yang cukup lama karena dilakukan di dalam oven yang menyebabkan jaringan kuat dan rapuh (Botanika, 2008).

Embedding dilakukan dengn membuat kotak kertas. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai jaringan. Sebelum jaringan atau sampel ditanam maka terlebih dahulu paraffin dalam kotak harus membeku pada bagian dasarnya sehingga memungkinkan objek tidak langsung menempel pada dasar kertas. Blok paraffin yang akan disayat dulu maka dibentuk dulu (trimming). Bentuk blok disesuaikan dengan bentuk pitanya yang diinginkan. Hal in dikarenakan penampang blok paraffin menggambarkan blok pita yangg akan diiris.Letak mata pisau pada mikrotom sangat menentukan hasil yang diperoleh. Pisau dibersihan dengan xylol dari sisa-sisa paraffin yang menempel. Hasil sayatan diambill dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Hasil sayatan diletakkan dalam bak khhusuus dann diperhatikan urutannya. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca objek selanjutnya diletakkan di atas meja penangans (heating plate) (Botanika, 2008). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelekat alami yang sangat baik (Hugo, 2008).

Sangatlah penting dilakukan rehidrasi atau dehidrasi sebelum dilakukan pewarnaan. Hal itu baru dilakukan bila paraffin dalam sayatan sudah larut dan biasanya dilarutkan dalam xylol (Botanika, 2008).
Proses sectioning diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Irislah sedemikian rupa, sehingga preparat akan terletak tepat berada di tengah blok. Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasindengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa

Mikrotom ada beberapa macam yaitu :

1.     Mikrotom geser (sliding mikrotome). Pada alat ini, jaringan tetap berada pada tempatnya, sedang pisaunya yang bergerak. Pada umumnya jaringan yang akan dipotong dengan mikrotom geser adalah jaringan yang tanpa penanaman (embedding) terlebih dulu. Disini tidak akan terjadi pita irisan. Jaringan yang akan diiris sebelumnya dapat diwarnai dengan pewarnaan tunggal, ataupun tanpa pewarnaan terlebih dahulu. Metode ini banyak dikerjakan untuk pengirisan jaringan tumbuh-tumbuhan.

2.     Mikrotom beku (freezing microtome). Alat ini dihubungkan dengan tabung berisi CO2 dingin, melalui suatu pipa karet. Mikrotom ini, keadaannya sama dengan mikrotom geser yaitu jaringan tetap berada pada tempatnya sedang pisau mikrotomnya yang bergerak ke muka dan ke belakang.

3.     Mikrotom putar (rotary microtome). Berbeda dengan 2 jenis mikrotom diatas, yaitu bahwa pada mikrotom ini, pisau tetap pada tempatnya sedang jaringannya yang bergerak ke atas dan ke bawah. Jenis mikrotom ini yang biasanya digunakan untuk pembuatan sediaan irisan dengan metode parafin (Rina, 2010).

IV.            ALAT DAN BAHAN

a.     Alat

1.     Papan paraffin                         1 buah

2.     Pisau bedah                             1 buah

3.     Jarum pentul                            secukupnya

4.     Gunting bedah                         1 buah

5.     Cawan petri                             1 buah

6.     Pinset                                      1 buah

7.     Gelas bekker                           1 buah

8.     Objek glass                             9 buah

9.     Deg glass                                 9 buah

10.    Kuas                             1 buah

11.    Staining jar                  1 buah

12.    Tabung untuk fiksasi    1 buah

13.    Gelas-gelas petri         secukupnya

14.    Mikrotom                     1 buah

15.    Hot plate                     1 buah

16.    Mikroskop                   1 buah

b.     Bahan

1.     Usus  katak (Rana sp)  1 buah

2.     Alcohol 70%, 80%, 90%, 96%, absolute (100%)       secukupnya

3.     Larutan xylol                            secukupnya

4.     Paraffin                                    secukupnya

5.     Larutan Bouine             secukupnya

6.     Larutan hematocilin                 secukupnya

7.     Eosin                                        secukupnya

8.     Larutan Entellan                       secukupnya

9.     Aquades                                   secukupnya

10.  Meyer albumin                         secukupnya

11.  Larutan ringer                          secukupnya

V.              CARA KERJA

1.     Mneyiapkan alat dan bahan yang diperlukan dalam praktikum.

2.     Narcose (pembiusan),

Ø  Membasahi kapas dengan eter kemudian ditempelkan pada nares anterior katak

3.     Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting),

Ø  Membedah tubuh katak Rana sp dan mengambil organ bagian ususnya.

4.     Washing

Ø  Merendam organ pada alkohol 70%, mengganti alkohol tiap 1 jam hingga warna alkohol menjadi jernih

5.     Dehidrasi

Ø  Merendam organ pada alkohol 80% selama 1 jam

Ø  Merendam organ pada alkohol 90% selama sehari

Ø  Merendam organ pada alkohol 96 % selama 1 jam

Ø  Merendam organ pada alkohol absolute selama 1 jam

6.     Clearing

Ø  Merendam organ pada larutan toluol selama semalam

7.     Infiltrasi

Ø  Memasukkan organ pada kotak  kertas yang berisi toluol:paraffin (1:1) cair, oven dalam suhu 56^o - 58^o C, selama 1 jam

Ø  Memasukkan organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56^o - 58^o C, selama 1 jam (I)

Ø  Memasukkan organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56^o - 58^o C, selama 1 jam (II)

Ø  Memasukkan organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56^o - 58^o C, selama 1 jam (III)

8.     Embedding

Ø  Menanam organ dengan memposisikan organ dalam kondisi melintang/membujur pada paraffin cair dalam kotak kertas

9.     Section (pemotongan)

Ø  Mengeluarkan Blok paraffin dari cetakan, diiris dengan scalpel sehingga berbentuk segi empat

Ø  Melekatkan blok paraffin pada holder kayu, memastikan tidak goyah

Ø  Memasang holder+paraffin pada rotary mikrotom

Ø  Memotong dengan ketebalan 5 mikron, jika pemotongan belum mencapai organà10-15 mikron

Ø  Menyiapkan kertas polos untuk tempat pita preparat serta kuas untuk mengambil coupes dari pisau mikrotom

10.  Affixing

Ø  Menetesi Objek glass dengan albumin meyer

Ø  Meletakkan Coupes yang terpilih di atas objek glass tersebut dan merentangkan

11.  Deparafinisasi

Ø  Menginkubasi preparat pada suhu 65 C selama 30 menit

Ø  Merendam preparat dalam xylol (2 x 30 menit)

Ø  Merendam preparat dalam alcohol absolute (2 x 10 menit)

Ø  Merendam preparat dalam alcohol 90% selama 5 menit

Ø  Merendam preparat dalam alcohol 70% selama 1 menit

Ø  Merendam preparat dalam alcohol 50% selama 1 menit

Ø  Merendam preparat dalam alcohol 30% selama 1 menit

12.  Staining (Hematoxylin&Eosin)

Ø  Membersihkan cairan yang berlebihan di sekeliling jaringan

Ø  Menstain dengan larutan hematoxylin, ratakan

Ø  Menginkubasi pada suhu ruang selama 5 menit

Ø  Membilas pada aliran air kran dalam posisi terbalik (bagian yang ada jaringannya di sebelah bawah)

Ø  Membersihkan cairan yang berlebihan di sekeliling jaringan

Ø  Menstain dengan larutan eosin selama 30 detik

Ø  Membilas pada aliran air kran dalam posisi terbalik (bagian yang ada jaringannya di sebelah bawah)

Ø  Mendehidrasi preparat dalam alcohol absolute (2 x 2 menit)

Ø  Membersihkan  preparat dalam xylol (2 x 10 menit)

13.  Mounting

Ø  Menutup preparat dengan Canada balsam/enthellan dan degglass (Apabila hasil  pewarnaan jelek, tidak perlu mounting)

14.  Labeling,

Ø  Menulis data lengkap dengan preparat yang telah dibuat pada label yang kemudian ditempel pada salah satu sisi obyek glass

15.  Mendata hasli praktikum

Ø  Membuat gambar Preparat yang telah berhasil secara lengkap dan membuat laporan

VI.            HASIL PERCOBAAN DAN PEMBAHASAN

      Metode paraffin termasuk metode sayatan yang banyak digunakan, karena hampir semua jaringan dapat dipotong dengan metode ini. Pengamatan secara mikroskopis dari suatu jaringan dalam berbagai kondisi dan berbagai elemen jaringan dapat diamati atau diteliti melalui preparat permanen yang dibuat dengan metode paraffin. Pembuatan preparat dengan metode paraffin adalah metode yang paling umum digunakan untuk pembuatan preparat permanent, baik pada hewan ataupun pada hewan (Anonim, 2011).

      Metode parafin merupakan cara pembuatan preparat permanen yang menggunakan parafin sebagai media embedding dengan tebal irisan kurang lebih mencapai 6 mikron-8 mikron. Metode ini memiliki irisan yang lebih tipis daripada menggunakan metode beku atau metode seloidin yang tebal irisannya kurang lebih mencapai 10 mikron. Langkah-langkah penting dalam metode ini antara lain fiksasi, pencucian, dehidrasi, penjernihan, embedding, penyayatan (section), penempelan, pewarnaan, dan penutupan. Larutan fiksasi yang digunakan untuk proses fiksasi adalah larutan Bouine. Larutan fiksasi ini merupakan larutan yang mampu bereaksi dan menandai suatu sel dengan spesimen diiris setipis mungkin. Hal ini mendukung laju fiksasi dalam sel (Botanika 2008).

Berikut langkah-langkah dalam metode paraffin secara umum adalah:

A.    Pembiusan (Narcose)

Pembiusan merupakan proses yang bertujuan khusus untuk preparat hewan yaitu untuk memudahkan pengambilan jaringan atau bagian jaringan pada hewan. Pembiusan tidak perlu dilakukan jika yang akan diambil atau diamati adalah jaringan yang menyangkut kelenjar-kelenjar(endokrinologi), karena mungkin akan berpengaruh terhadap hormon-hormon yang terkandung di dalamnya.
Senyawa kimia yang umumnya digunakan untuk pembiusan adalah:

1.     Eter, biasanya digunakan untuk membius tikus, kelinci, marmut, dan anjing

2.     Kloroform, biasanya digunakan untuk membius kucing dan kera.
Senyawa kimia lainnya yang dapat digunakan untuk pembiusan adalah prokain, aseton- CHCl3, Morfin HCl, methane, alcohol, klereton, kloral hidrat, kokain, dan garam magnesium.

B.    Pengambilan jaringan (Diseksi/Collecting)

Diseksi merupakan proses pengambilan jaringan atau bagian jaringan dari sumber alami baik berupa tumbuhan ataupun hewan yang akan digunakan sebagai bahan dasar dalam mikroteknik. Pada jaringan hewan setelah dilakukan pengambilan diperlukan proses pencucian (washing).
Pencucian (washing) adalah suatu tahap yang membedakan metode paraffin hewan dengan tumbuhan. Percobaan ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan dengan tumbuhan.pencucian ini perlu dilakukan karena jaringan yang diambil pada hewan sering kali dalam keaadaan kotor oleh darah atau kotoran seperti pada organ pencernaan. Selain itu jaringan hewan lebih cepat mengalami dehidrasi yang merusak jaringan, sehingga perlu secepat mungkin dimasukan ke dalam larutan fisiologis sebagai fiksasi sementara. Pencucian pada pembuatan preparat hewan menggunakan larutan garam fisiologis. Larutan garam fisologis yang bisa dipakai:

1.     NaCl 0.8-0.9%

2.     Larutan Ringer, dapat digunakan untuk hewan berdarah panas dan dingin. Komposisi larutan ringer adalah:

·       NaCl, CaCl, KCl, K2CO3, air untuk hewan berdarah panas.

·       NaCl, CaCl, KCl, Na2CO3, air untuk hewan berdarah dingin.

·       NaCl merupakan larutan fisologis yang umumnya digunakan, biasanya dalam waktu 15 menit. Perlu diperhatikan, jangan sekali-kali dicuci dengan air, karena akan menyebabkan pembengkakan sel.
Syarat dalam pengambilan objek ini adalah sebagai berikut:

a.      objek yang diambil dalam kondisi sehat

b.     objek yang diambil tidak boleh rusak saat proses pengambilan

c.      menggunakan pisau yang tajam

d.     ukuran jaringan yang diambil kurang lebih 0.5 cm

e.      langsung dicuci dan difiksasi.

C.    Fiksasi (Fixation)

Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran.. media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan. Fiksatif yang sering digunakan dalam pembuatan preparat tumbuhan adalah FAA (Formaldehyde Acetic Acid).

FAA ini juga dapat digunakan untuk jaringan hewan. Formula FAA untuk jaringan hewan adalah:

·       Formalin …………………………. 10 ml

·       Alkohol 70% …………………………. 90 ml

·       Asam asetat grasial …………………. 2 ml

Lama fiksatif 3 jam, tanpa pencucian. Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada:

·       Jenis jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan intestinum

·       Tebal atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan yang difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan

·       Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.

Proses yang disiapkan dalam menyiapkan materi segar dalam pengamatan mikroskopis yaitu fiksasi. Tujuan dilakukannya fiksasi adalah mencegah kerusakan jaringan,            Faktor-faktor yang berperan dalam fiksatif adalah buffer (pH), suhu yang rendah mencegah autolisis,untuk mendapatkan daya penetrasi yang tinggi digunakan irisan setipis mungkin, perubahan volume, osmolaliitas pada larutan fiksatif, penambahan deterjen sehingga fiksatif cepat masuk, konsentrasi, dan waktu fiksatif. Dehidrasi memiliki fungsi menghilangkan air dalam jaringan. Bahan yang digunakan untuk dehidrasi harus mampu menggantikan fungsi air. Dehidrasi yang baik dilakukan secara bertahap yaitu mulai dari konsentrasi 70% sesuai dengan pelarut Bouin formol kemudian berturut-turut ke dalam alkohol 80%, 90%, 96% dan alkohol absolut. Pada setiap konsentrasi dilakukan pengulangan 3 kali .

Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin adalah:

·       mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.

·       mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis.

·       Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan komponen jaringna fiksatif.

D.     Aerasi
Aerasi merupakan proses penarikan udara dari dalam jaringan dengan cara di vakum, yang bertujuan untuk memudahkan fiksatif masuk ke dalam jaringan dengan sempurna,. Tahap ini diutamakan pada jaringan tumbuhan, karena sel pada jaringan hewan hanya terdiri dari membrane sel dan vakuola yang kecil, sehingga udara yang tersimpan dalam sel atau jaringan hanya sedikit dan mudah keluar melalui membrane sel yang tipis saat fiksasi. Sedangkan pada sel tumbuhan memiliki dinding sel dan vakuola yang besar, sehingga mengandung banyak udara yang sulit secara alami keluar dari sel atau jaringan melalui dinding sel yang tebal waktu fiksasi.

E.     Dehidrasi (dehydration)

Dehidrasi adalah proses penarikan air dari dalam jaringan dengan menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dehidrasi bertujuan untuk mengeluarkan air dari dalam jaringan yang telah difiksasi. Proses dehidrasi merupakan serangkaian proses dengan cara memasukan sample ke dalam larutan dehidrasi secara berseri dari konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dengan mengurai konsentrasi air. Dehidran yang paling umum digunakan pada mikroteknik dengan metode paraffin adalah alkohol. Jenis dehidran lain adalah dioksan, N-butyl alcohol, aniline oil dan bergamot oil. Alkohol merupakan dehidran yang umum digunakan, karena relatife lebih murah dan mudah diperoleh, tapi mampu menghasilkan hasil yang baik, bahkan untuk jenis-jenis jaringan-jaringan lunak seperti otak, sumsum tulang belakang, dan embrio. Dalam penggunaan alcohol dipakai serial dengan konsentrasi yang berbeda, dimulai dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi (35%-50%-70%-80%-95%-100%). Lama perendaman tergantung untuk masing-masing konsetrasi berkisar 1-6 jam. Alcohol 70% sebagai stoping point, jaringan di malamkan.

Proses dehidrasi dalam berbagai konsentrasi alcohol dilakukan setingkat demi setingkat. Tujuannya adalah untuk menjaga agar tidak terjadi perubahan secara tiba-tiba dalam terhadap sel jaringan, sehingga perubahan struktur sel yang terjadi sekecil mungkin. Apabila proses dehidrasi ini tidak sempurna berarti masih ada molekul air dari dalam jaringan. Ketidaksempurnaan proses dehidrasi ini dapat diketahui dengan jelas setelah jaringan dimasukan ke dalam zat penjernih, dimana jaringan tidak menjadi transparan walaupun jaringan telah lama dalam larutan penjernih. Jika terjadi hal yang demikian, maka jaringan harus dikembalikan ke dehidran.

F.     Penjernihan (Clearing)

Clearing merupakan proses harus segera dilakukan setelah dehidrasi. Tujuan dari penjernihan ini adalah menggantikan tempat alcohol sementara dalam jaringan yang telah mengalami proses dehidrasi dengan suatu solven atau medium penjernih sebelum proses penanaman dalam paraffin. Medium penjernih ini akan menjernihkan atau mentranparankan jaringan agar kemudian dapat terwarnai dengan baik dan memperlihatkan warna sesuai dengan warna pewarnanya. Lama jaringan dalam medium penjernih tergantung pada:

·       Ketebalan dan tingkat kepadatan jaringan

·       jenis reagen yang dipakai

·       bila dehidrasi telah sempurna, maka lamnya xilol atau benzene adalah setengah hingga tiga jam. Bila dibiarkan cukup lama dalam penjernih, maka jaringan akan mengeras dan rapuh yang tentunya sulit untuk di sayat.

·       Jenis jaringan, seperti syaraf atau kelenjar limfa sebaiknya penjernih dalam menggunakan minyak cadar atau kloroform, karena jaringan tersebut cenderung menjadi keras atau getas bila dijernihkan dengan xilol atau benzene.
Bahan-bahan yang dapat digunakan sebagi penjernih:

1.     minyak aniline

2.     Benzene

3.     karbon tetraklorida

4.     karbon bisulfida

5.     minyak kayu cadar

6.     kloroform

7.     minyak cengkeh

8.     Xylol

G.    Infiltrasi (Infiltration)

Infiltrasi adalah suatu usaha menyusupkan media penanaman (embedding media) ke dalam jaringan dengan jalan menggantikan kedudukan dehidran dan bahan penjernih (clearing agents). Media penanaman yang digunakan dalam infiltrasi ini adalah paraffin. Proses infiltrasi ini umumnya dilakukan di dalam oven yang suhunya dapat diatur sesuai titik leleh jenis paraffin yang digunakan. Pada jaringan hewan bisa langsung digunakan paraffin keras dengan titik leleh 56-58C.

Dalam proses infiltrasi sebaiknya jaringan jangsn langsung dimasukan ke dalam paraffin murni, tetapi sebelum paraffin murni jaringan dimasukkan terlebih dahulu ke dalam campuran bahan penjernih dan paraffin murni dengan perbandingkan yang sama. Waktu yang diperlukan jaringan campuran ini terlalu lama cukup berkisar antara 10-30 menit saja tergantung besar kecilnya jaringan. Tujuan dari semua ini adalah untuk menghindari jaringan dsri prubshsn lingkungsn yang sangat mendadak. Perubahan-perubahan yang mendadak ini dapat menimbulkan kerusakan pada jaringan itu sendiri, seperti jaringan menjadi sangat mengkerut,dll.

Setelah dalam campuran paraffin dan bahan penjernih, jaringan baru dipindahkan ke paraffin murni sebanyak tiga kali ganti yang masing-masingnya berkisar antara 30-60 menit. Usahakan jaringan jangan terlalu lama ditinggalkan dalam oven.
Tujuan dari tahap infiltrasi ini adalah untuk mengisi jaringan dengan paraffin sebagi pengikat jaringan agar tetap memiliki bentuk dan struktur yang sama seperti hidup.

H.    Penanaman (Embedding)

Embedding atau penanaman merupakan proses memasukan atau penanaman jaringan ke dalam balok-balik paraffin (cetakan) sehingga memudahkan proses penyayatan dengan bantuan mikrotom. Tujuan dari tahap ini adalah untuk membuat balok paraffin yang berisi jaringan yang akan dibuat preparat permanen.

Embedding merupakan proses pelilinan suatu organ dengan menggunakan kotak kertas. Proses ini memudahkan dalam membuat irisan yang sangat tipis dengan menggunakan mikrotom. Beberapa keuntungan menggunakan kotak kertas dalam embedding yaitu bisa membuat arah sayatan dan menandai suatu jaringan. Jaringan atau sampel akan ditanam di ketas kotak, dengan terlebih dahulu parafin membeku pada bagian dasar dalam kotak dan setelah penempelan jaringan dilanjutkan dengan penutupan dengan parafin sampai membeku.

Gambar proses embedding

Selanjutnya dilakukan pengeblokan atau embedding, pengeblokan ini mengguna-kan kotak atau takir yang dibuat dari kertas kalender. Pada saat pengeblokan spesimen diletakkan sesuai posisi yang diinginkan. Setelah itu parafin didinginkan dengan segera. Setelah dingin maka dilakukan pengirisan, pengirisan digunakan alat mikrotom biasanya dengan ukuran 10 mikron sampai 14 mikron. Irisan akan berbentuk seperti pita-pita. Pemindahan irisan menggunakan kuas kecil yang telah dibasahi ujungnya dengan air (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Paraffin yang digunakan untuk menanam jaringan harus memiliki titik leleh yang sama dengan paraffin yang digunakn waktu infiltrasi. Paraffin ketiga yang dipakai pada infiltrasi dapat digunakan langsung untuk penanaman dengan syarat memang sudah bersih dari bahan penjernih.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam penanaman adalah:

·       Paraffin yang digunakan benar-benar bersih dan murni

·       Peralatan yang digunakan benar-benar khusu untuk prose situ saja

·       Pembuatan balok sebaiknya dilakukan dekat oven atau lampu Bunsen agar lebih cepat, susunjaringan sesuai dengan orientasi yang direncanakan.

·       Jaringan sebaiknya diberi label untuk menghindari kesalahan atau bertukar.

·       Untuk jenis-jenis jaringan yang halus perlu dikerjakan di bawah lup

·       jangan sampai ada gelembung udara pada balok paraffin yang dibuat terutama dekat jaringan.

I.       Penyayatan (Sectioning)

Proses penyayatan adalah pembuatan sayatan atau pita dari balok parafin yang telah terbentuk dengan menggunakan mikrotom, yang bertujuan untuk membuat sayatan jaringan dan dapat dilihat jelas dari dalam mikroskop. Pembuatan irisan dengan metode parafin memiliki beberapa keuntungan, diantaranya adalah yaitu proses embedding lebih cepat dan lebih simpel, material embedding dapat disimpan dalam waktu yang lama pada kondisi kering, serta dapat membuat irisan yang tipis. Embedding menggunakan paraffin sangat baik digunakan untuk studi embriologi, anatomi dan sitologi (Khasim, 2002).
Proses penyayatan (sectioning) diawali dengan pengirisan blok parafin dengan scalpel, sehingga permukaan blok parafin yang akan diiris dengan mikrotom berbentuk segi empat. Letak mata pisau pada mikrotom menentukan hasil yang diperoleh. Hasil sayatan diambil dengan menggunakan kuas secara hati-hati. Pita hasil sayatan ditempel pada kaca objek dengan menggunakan meyer albumin. Kaca obyek tersebut diletakkan di atas meja penangas ( haeting plate). Meyer albumin memiliki kandungan putih telur dan gliserin dan merupakan pelakat alami yang sangat baik (Hugo 2008).Proses pewarnaan dilakukan setelah preparat dideparafinasi dengan merendam preparat pada xylol. Salah satu pewarna metode parafin pada jaringan hewan adalah hematoxylin dan Eosin. Zat warna hematoxilin ini bersifat aquaosa.

Mikrotom adalah mesin untuk mengiris spesimen biologi menjadi bagian yang sangat tipis untuk pemeriksaan mikroskop. Beberapa mikrotom menggunakan pisau baja dan digunakan untuk mempersiapkan sayatan jaringan hewan atau tumbuhan dalam histologi(Wikipedia).

Jenis-jenis mikrotom yang bisa dipakai pada mikroteknik adalah:

·       Rocking microtom, cara kerjanya seperti mengatam kayu, biasanya untuk organ-organ keras seperti kayu

·       Rotary microtom atau mikrotom putar, cara kerjanya dengan di putar yang akan mengerakan objek maju dan naik turun, sementara pisaunya tetap. Mikrotom ini biasanya dipakai dalam mikroteknik metode paraffin

·       Sliding microtom atau mikrotom sorong, dimana jaringan tetap posisinya dan pisau yang bergerak maju dan mundur. Mikrotom ini sering digunakan pada mikroteknik metode paraffin, walau umumnya digunakan pada penyayayan jaringan yang di tanam dalam celloidin. Biasanya digunakan pada objek-objek yang keras

·       Freezing microtom atau mikrotom beku, sering digunakan untuk penyayatan jaringan yang tidak ditanam dalam paraffin maupun dalam celloidin, jadi jaringan yang disayat adalah jaringan yang tidak di tanam tetapi dibekukan dengan memakai gas CO2. Keuntungan dari mikrotom ini adalah waktu yang dipakai lebih pendek, karena langsung disayat setelah proses fiksasi. Kerugiannya adalah bila temperature kamar tinggi, objek menjadi lunak sehingga sulit dipotong.

Hal-hal yang harus diperhatikan dalam proses penyayatan ini adalah:

·       Mikrotom harus seberat mungkin

·       Meja tempat mikrotom harus stabil

·       Pisau harus cocok dengan mikrotom

·       Posisi pisau harus stabil

·       Mata bisau harus tajam, bersih dan suhunya harus sama dengan balok jaringan yang akan disayat.

J.      Penempelan dan Afiksasi (Afixing)

Affixing adalah proses pelekatan atau penempatan sayatan jaringan pada kaca objek dengan bantuan media pelekat tertentu. Tujuan penempelan ini adalah untuk menempelkan pita paraffin yang sudah berisi sayatan jaringan pada kaca objek.
Media pelekat yang umumnya digunakan adalam mayers albumen yang formulanya adalah sebagai berikut :

·       Putih telur sebanyak 50 bagian§

·       Gliserin sebanyak 50 bagian§

·       Kristal Tymol beberapa butir§

·       Akuadest beberapa tetes§

K.    Deparafinasi dan Pewarnaan (Staining)

Deparafinasi adalah suatu tahap menjelang proses pewarnaan dengan menggunakan xilol untuk membersihkan paraffin dari jaringan dan kaca objek. Pengerjaan deparafinasi aserial atau berkelanjutan dengan pengerjaan pewarnaan. Tujuan dari tahap ini untuk membersihkan jaringan dan kaca objek dari paraffin.

Pewarnaan merupakan suatu tahap dalam mikroteknik untuk mempertajam atau memperjelas berbagai elemen jaringan, terutama sel-seknya, sehingga dapat dibedakan dan ditelaah dengan mikroskop.tanpa pewarnaan, jaringan akan transparan sehingga sulit untuk diamati.

Pewarnaan akan memperjelas rinci suatu jaringan sehinnga mudah untuk dipelajari. Pewarnaan dibedakan antara non vital dengan vital

·       Pewarnaan non vital, pewarnaan dilakukan setelah jaringan dimatikan melalui fiksasi. Teknik ini merupakan teknik dan cara yang paling alzim digunakan, terutama untuk pekerjaan rutin sehari-hari, terutama pembuatan preparat/sediaan praktikum bagi mahasiswa.

·       Pewarnaan vital, maka proses pewarnaan dilakukan selagi jaringan/sel masih dalam keadaan hidup. Sel-sel yang masih hidup tersebut diharapkan mampu untuk menyerap warna maupun mengikat/memfagosit partikel-partikel zat warna. Dengan demikian zat warna yang hendaknya yang tidak bersifat toksik bagi sel-sel tersebut. Sebagai contoh, tinta china dan lithium carmine secara umum digunakan untuk mengamati penyebaran sifat sel-sel RES, karena sel-sel tersebut mampu memfagosit zat warna.

·       Pewarnaan supra-vital diharapkan pada hasil kultur sel dan jaringan
Dalam arti yang sangat luas, zat warna mencakup bahan organic dan bahan anorganik, yang mengadakan ikatan dengan jaringan lebih jelas untuk diamati.

Ditinjau dari berbagai segi, maka zat warna dapat kita bedakan atau kelompokan pada kategori-kategori tertentu. Berikut ini adalah pembagian zat warna bergasarkan berbagai kategori tersebut.

·       Berdasarkan sifatnya, meliputi:

1.     Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang tidak berwarna. Contoh: acid fuchsin, eosin, dan lain sebagainya

2.     Zat warna basa, adalah garam-garam dari basa pembawa warna dengan radikal asam yang tidak berwarna.

·       Berdasarkan asalnya, meliputi:

1.     Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hehatoxylin campechianum)

2.     Zat warna sintetis, mencakup jenis-jenis zat warna yang dibuat di pabrik. Contoh: basic fuchsin, dibuat dari campuran analin dan paratoluidin.

·       Berdasarkan kemampuan mengenai warna (staining power), meliputi:

1.     Zat warna substantife

Jenis zat warna yang mampu mewarnai jaringan secara langsung. Contoh janus green B, Neutral red.

2.     Zat warna ajektif

Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan.

·       Berdasarkan jumlah/ komposisi zat warna yang digunakan,meliputi:

1)     Pewarna tunggal (single staining), hanya menggunakan satu jenis zat warna, contohnya untuk melihat polysacharida sulphate ester serta hyaluronic, maka digunakan zat warna tunggal gentian violet.

2)     Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin

3)     Pewarnaan rangkap tiga (triple staining), menggunakan tiga jenis zat warna, contohnya formula Marllory triple stai yang menggunakan zat-zat warna acid fuchsin, aniline blue serta orange G.

4)     Pewarnaan rangkap empat, jarang digunakan dalam kerja rutin, kecuali untuk tujuan khusus.

·       Berdasarkan struktur jaringan yang akan diwarnai, meliputi:L

1)     Pewarnaan umum, seperti Hematoxillin eosin, fastgreen safrani

2)     Pewarnaan khusus, seperti pewarnaan jaringan ikat yaitu Molary azan, aniline blue, asam phospatungistik, korhensen, dan lain-lain.

Dengan adanya preparat utuh maka dapat diamati bagian-bagian jaringan dan jenis sel yang ada dalam satu preparat. Dalam pembuatan preparat utuh diupayakan permanen atau awet agar sewaktu-waktu dapat diamati kembali. Dalam pembuatan preparat hendaknya dipahami karakteristik yang akan diambil sebagai spesimen. Perbedaan karakteristik hewan yang akan diambil sebagai spesimen menentukan larutan fiksatif dan zat warna yang akan digunkan dalam pembuatan preparat (Setjo, 2004).

Karakteristik hewan yang akan diambil spesimennya juga menentukan waktu pada tahap-tahap pemrosesan. Misalnya waktu yang berlebih pada suatu tahap pengecatan akan mengakibatkan suatu warna menjadi terlalu gelap dan mungkin warna lainnya menjadi kurang atau bahkan hilang. Keberhasilan pembuatan preparat permanen ini tergantung pada lima tahap yang utama yaitu fiksasi, dehidrasi, penjernihan, perembesan dan pengeblokan parafin serta pewarnaan. Larutan fiksatif yang dipilih, perembesan parafin yang bagus dan zat warna yang akan digunakan menentukan keberhasilan preparat irisan (Setjo, 2004).

Pada prinsipnya pembuatan preparat irisan terdiri atas beberapa tahap yaitu koleksi specimen, fiksasi, dehidrasi, penjernihan, infiltrasi, pengeblokan, pengirisan, penempelan, pewarnaan dan mounting. Prinsip koleksi specimen adalah specimen tidak mengalami kekeringan dan kerusakan sebelum difiksasi. Tujuan fiksasi adalah untuk mematikan dengan cepat spesimen yang berupa jaringan dan sel-sel juga utuk mempertahankan struktur sel dan jaringan sebagaimana aslinya. Udara dalam jaringan spesimen harus dikeluarkan terlebih dahulu kemudian diganti dengan larutan fiksatif (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Selanjutnya dilakukan dehidrasi yaitu tahap pengeluaran air dari jaringan dengan perendaman alkohol secara bertingkat dan dalam jangka waktu tertentu. Kemudian pengambilan alkohol dilakukan dengan perendaman dalam xylol secara bertahap dengan jangka waktu tertentu. Proses penggantian larutan penjernih dengan merendam spesimen dalam parafin. Penggantian xylol dalam jaringan oleh parafin berlangsung secara berangsur-angsur. Proses penggantian ini berlangsung di dalam oven sehingga xylol tidak menguap dan parafin tidak membeku. Temperatur oven lebih tinggi sedikit di atas titik cair parafin (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Penempelan menggunakan perekat albumin meyer kemudian disimpan dalam kotak pengering (hot plate). Selanjutnya akan dilakukan pewarnaan dan mounting. Dalam proses pewarnaan dilakukan dalam jangka waktu tertentu, jika terlalu lama atau terlalu singkat dapat menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau bahkan terlalu gelap. Selanjutnya dilakukan mounting dengan ditetesi balsam kanada sehingga irisan akan tetap awet dengan struktur sel serta jaringan (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Proses penempelan spesimen ke kaca benda tidak benar-benar melekat sehingga saat pewarnaan spesimen ada yang lepas. Agar spesimen dapat menempel sempurna pada kaca benda dibutuhkan tenggat waktu yang cepat antara peletakkan spesimen pada kaca benda yang telah diberi pelekat berupa albumin meyer. Setelah benar-benar melekat di kaca benda maka irisan yang berada di kaca benda dipanaskan di atas lampu spiritus untuk lebih memaksimalkan perlekatannya (Widjajanto dan Susetyoadi Setjo, 2001).

Zat warna yang digunakan tidak hanya satu macam karena tidak semua sel dapat menyerap satu macam zat warna. Pada saat pewarnaan preparat jantung merpati inisel dalam jaringan tidak terwarnai. Hal ini dapat disebabkan oleh waktu yang digunakan untuk pemberian warnanya terlalu singkat sehingga zat warna belum terserap sempurna oleh jaringan. Pewarna yang diberikan pada irisan dalam jangka waktu tertentu, kurang atau lebih waktu yang digunakan menyebabkan warna preparat menjadi kurang atau terlalu gelap. Sedangkan hasil preparat yang tidak utuh dapat disebabkan oleh suhu sekitar ruangan yang kurang mendukung saat dilakukan pengirisan selain itu masih tersisanya air atau alkohol dalam jaringan juga dapat menyulitkan dalam pengirisan.

Percobaan ini membuat preparat dengan menggunakan usus katak Rana sp dengan metode parafin. Usus katak Rana sp tersebut dipotong secara melintang dengan ketebalan 10 mm. Selanjutnya difiksasi menggunakan larutan alkohol 96% dengan tujuan untuk menjaga atau mengawetkan seluruh stuktur sel sehingga sedapat mungkin berada dalam keadaan sama atau hampir sama dengan keadaan aslinya pada waktu masih hidup. Kemudian di dehidrasi dengan menggunakan alkohol bertingkat yang dimulai dari konsentrasi 70%, 80%, 90%, dan 96% masing-masing selama 30 menit, dengan tujuan untuk menghilangkan kandungan air. Selanjutnya melakukan dealkoholosasi yang menggunkan perbandingan xilol : alcohol yaitu 1:3, 1:1, dan 3:1 masing-masingselama 30 menit, dengan tujuan mengeluaran alkohol dari jaringan tersebut juga maksimal sehingga larutan xilol inilah yang nantinya dapat terikat langsung dengan parafin dan agar jaringan akar tersebut dapat beradaptasi.

Selanjutnya dilakukan perendaman dengan menggunakan xilol murni yaitu xilol I dan xilol II masing-masing 30 menit, dengan tujuan agar jaringan betul-betul bebas dari alkohol sehingga hanya ada xilol yang tersisa. kemudian dilanjutkan perendaman menggunakan perbandingan xilol : parafin yaitu 1 : 9 selama 30 menit, dengan tujuan untuk menghilangkan xilol dari jaringan. Kemudian melakukan infiltrasi dengan menggunakan parafin murni, infiltrasi I dilakukan untuk mencelupkan, hal tersebut dilakukan untuk menghilangkan kandungan xilol secara maksimum serta untuk merekatkan jaringan dan infiltrasi II untuk mencetak kedalam box kecil yang sudah disediakan, hal tersebut dilakukan agar jaringan dapat dengan mudah terpotong tanpa merusak jaringan akar tersebut. Kemudian dilakukan pengirisan dengan menggunakan mikrotom, namun hal ini tidak dilakukan karena alat tersebut sudah tidak dapat digunakan lagi.

Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan medode ini (Praptomo, 2010).

Berikut gambar pengamatan ke 8 preparat:

preparat	Gambar pengamatan
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Dari ke 8 preparat terlihat preparat yang berhasil preparat nomer 2 dan 8 saja, sedangkan nomer 1, 3,4,5,6,7 preparat mengalami penumpukkan organ sehingga tidak terlihat organ asli pada usus katak Rana sp. Berikut pengamatan mikroskopik secara teori yaitu:

Pengamatan mikroskopis usus katak Rana sp secara teori:

Dari pembesaran kecil sebuah sayatan dari sepotong usus, nampak sekali sekelompok jonjot-jontot vili yang berfungsi sebagai tempat penyerapan sari-sari makanan pada sistem pencernaan aves. Villi ini berbentuk seperti jari ( jonjot) yang merupakan proyeksi dari mukosa. Di dalam tiap villi terdapat pembuluhdarah kapiler dan lacteal yangberfungsi untuk transprot makanyang terabsorpsi. Dinding usus terdiri atas keempat lapisan yang sama dengan  lambung yaitu :

a.      Dinding lapisan luar

b.      Dinding lapisan berotot

c.      Dinding sub mukosa

d.      Dinding mukosa dalam

Dari pembesaran kecil sebuah sayatan dari sepotong usus, nampak sebagai kelompok lobuli yang secara kasar berisi enam, tiap – tiap lobules dibungkus oleh jaringan ikat dan pada sudut – sudut tertentu membentuk pulau pulau yang jelas juga mengandung pembuluh pembuluh darah dan duktus. Pulau – pulau tersebut adalah kanalis portarum. Pada sisi yang lurus dari lobulus, kadang dapat terlihat pembuluh – pembuluh yaitu vena interlobulares. Susunan jaringan ikat yang mengitari lobulus lebih tipis, hingga kurang jelas. Jaringan lobulus terdiri atas tali – tali radiar dari sel – sel beralternasi dengan sinusoid – sinusoid. Sinusoid – sinusoid berkonvergensi ke pembuluh di sentrum lobulus (vena sentralis)

VII.         KESIMPULAN

      Kesimpulan yang dapat diperoleh dari hasil percobaan yang telah dilakukan yaitu metode parafin merupakan suatu cara pembuatan preparat yang menggunakan parafin sebagai media penanamannya. Pembuatan preparat pada metode parafin ini terdiri dari beberapa tahap yaitu narcose (pembiusan), sectio (pemotongan), labelling, fiksasi, washing (pencucian), dehidrasi,  clearing (penjernihan),  infiltrasi, embedding, sectioning (pengirisan), affixing, staining (pewarnaan), mounting (penutupan), dan labelling (pelabelan).

      Kebaikan-kebaikan metoda ini adalah irisan yang dihasilkan jauh lebih tipis dari pada menggunakan metoda beku atau metoda seloidin. Dengan metoda beku, tebal irisan rata-rata diatas 10 mikron, tapi dengan metode paraffin tebal irisan dapat mencapai rata-rata 6 mikron. Irisan-irisan yang bersifat seri dapat dikerjakan dengan mudah bila menggunakan metode ini. Prosedurnya jauh lebih cepat dibandingkan dengan metode seloidin. Namun metode paraffin juga memiliki kelemahan yaitu jaringan menjadi keras, mengerut dan mudah patah. Jaringan-jaringan yang besar tidak dapat dikerjakaan, bila menggunakan metode ini. Sebagian besar enzim-enzim akan larut dengan medode ini.

VIII.       DAFTAR PUSTAKA

Amanda. 2007. Membuat Preparat Melintang Dengan Metode Parafin,http://monocotil.blogspot.com . Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Botanika, 2008.Fixation, Embedding, Sectioning, http://botanika.biologija.org . Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Carlson, B.M. 1988. An Introduction to Embryology. Ed 5. Philadelphia: W. B. Saunders

Hugo. 2008. Mayer Albumin. http://www.hardydiagnostics.com/catalog/hugo/MayersA Plbumin.htm. Tanggal akses 7 November 2008

Humason, Gretechen L. 1996. Animal Tissue Techniques. San Fransisco: W. H. Freeman and Company

Lianury, Robby N, 2000, Histologi, Universitas Hasanuddin Press, Makassar.

Nalbandov. 1990. Fisiologi Reproduksi Pada Mamalia dan Unggas. Jakarta: UI Press

Praptomo, 2010, Pembuatan Preparat Parafin Jaringan Tumbuhan (Mikroteknik), http://www.nagkoyo.com , Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Rina, 2011, Mikroteknik, http://rinaningtyas.blogspot.com , Diakses pada tanggal 20 September 2011.

Yatim, W. 1990. Reproduksi dan Embriologi. Bandung: Tarsito

Santoso, H. B. 2002. Bahan Kuliah Teknik Laboratorium. Universitas Lambung Mangkurat, Banjarbaru

IX.            LAMPIRAN

Dua  lembar jawaban pertanyaan parafin

Satu lembar Laporan sementara praktikum parafin

                                                                                          Surakarta, 7 Juni 2012

Mengetahui, Asisten (                                )

Praktikan, DEWI NOVIANA K4309023

JAWABAN PERTANYAAN DISKUSI

1.     Dalam pembuatan preparat, Waktu untuk melakukan infiltrasi jaringan adalah 4 jam dengan rincian langkh- langkahnya adalah:

a)     Memasukkan organ pada kotak  kertas yang berisi toluol:paraffin (1:1) cair, oven dalam suhu 56^o - 58^o C, selama 1 jam

b)     Memasukkan organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o - 58o C, selama 1 jam (I)

c)     Memasukkan organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o - 58o C, selama 1 jam (II)

d)     Memasukkan organ pada kotak kertas yang berisi paraffin cair, oven suhu 56o - 58o C, selama 1 jam (III)

2.     Larutan fiksatif yang saya gunakan adalah larutan FAA (Formaldehyde Acetic Acid. Hal ini dikarenakan

Ø  Fiksasi adalah usaha yang dapat mempertahankan elemen-elemen sel atau jaringan agar tetap berada pada tempatnya dan tidak mengalami perubahan bentuk maupun ukuran.

Ø  media yang digunakan untuk fiksasi disebut dengan fiksatif. Fiksatif terdiri dari unsur-unsur kimia yang dibuat dalam bentuk larutan atau gas yang berfungsi agar Jaringan tidak membusuk, dan dapat mempertahankan struktur jaringan.

Ø  Formula FAA untuk jaringan hewan adalah:

·       Formalin …………………………. 10 ml

·       Alkohol 70% …………………………. 90 ml

·       Asam asetat grasial …………………. 2 ml

Ø  Lama fiksatif 3 jam, tanpa pencucian. Lama jaringan disimpan dalam larutan fiksatif tergantung pada:

·       Jenis jaringan, misalnya jaringan tendon perlu waktu lebih lama dari jaringan intestinum

·       Tebal atau tipisnya jaringan atau ukuran jaringan, makin tebal dan besar jaringan yang difiksasi maka semakin lama waktu yang diperlukan

·       Jenis fiksatif, setiap fiksatif memiliki kecepatan penetrasi yang berbeda.

Ø  Tujuan dilakukan fiksasi dalam pembuatan preparat dengan menggunakan metode paraffin adalah:

·       mematikan (menghentikan proses-proses metabolisme)jaringan dengan cepat, sedangkan keadaan sedikit banyaknya mendekati keadaan semula.

·       mencegah terjadinya kerusakan jaringan yang disebabkan oleh mikroorganisme ataupun kerusakan oleh jenis enzim yang terkandung oleh jaringan itu sendiri, yang dikenal dengan autoloisis.

·       Meningkatkan daya pewarnaan karena adanya bahan-bahan keras (mordant) yang merupakan komponen jaringna fiksatif.

3.     Dalam pewarnaan menggunakan pewarna hematoxilin eosin. Hal ini dikarenakan:

·       Merupakan Zat warna asam, adalah garam-garam dari asam-asam pembawa warna dengan radikal basa yang tidak berwarna.

·       Merupakan Zat warna alami, berupa zat warna yang diperoleh dari alam, baik dari tumbuhan maupun dari hewan, contoh hematokillin, adalah zat warna yang berasal dari tumbuhan (Hematoxylin campechianum)

·       Merupakan Zat warna ajektif, Jenis zat warna yang pada penggunaannya, agar mampu mewarnai jaringan, harus menggunakan bantuan mordan. Contoh hematoxillin dari formula Ehrlich. Pada formula tersebut diberikan pula kalium alumunium secara berlebihan yang berfungsi sebagai mordan

·       Memiliki Pewarna ganda/ rangkap (double staining, menggunakan dua jenis zat warna, contoh pada system pewarnaan hematoxilin-eosin

·       Bersifat Pewarnaan umum pada struktur jaringan yang akan diwarnai.

LAPORAN SEMENTARA KELOMPOK 2

PRAKTIKUM EMBRIOLOGI DAN REPRODUKSI HEWAN

preparat	Gambar pengamatan
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.